Národní park reprezentuje výjimečně zachovalou ukázku krajiny říčního údolí v pahorkatinném stupni střední Evropy. Tato chráněná oblast o rozloze 63 km2 se táhne hlubokým údolím řeky Dyje po obou stranách státní hranice s Rakouskem, a to od Vranova nad Dyjí až ke Znojmu. Takřka celé údolí je porostlé přirozenými lesními společenstvy. Oblast se vyznačuje mimořádnými přírodními scenériemi, tvořenými skalami, meandry, suťovými poli a stržemi, ale i nivními loukami podél Dyje a prosluněnými lesostepmi. Pro území je charakteristická mimořádná rozmanitost a vysoká koncentrace živočišných a rostlinných druhů. Celé území je pro většinu návštěvníků zcela neznámé, neboť bylo v minulosti takřka celé v hraničním pásmu a tedy nepřístupné.
Celé údolí je takřka souvisle porostlé přirozenými a přírodě blízkými lesy. V západní části najdeme zbytky původních podhorských bučin s jedlí a tisem, které východním směrem střídají dubohabrové porosty. Mimo běžné lesní druhy dřevin se setkáme i se vzácnějšími a pro Podyjí charakteristickými druhy. Například višní mahalebkou, dřínem obecným, skalníkem celokrajným a jalovcem obecným. V inverzních polohách roste klokoč zpeřený, růže alpská a javor klen. V teplejší jihovýchodní části parku se vyskytuje kalina tušalaj, lýkovec vonný, dub žlutavý, růže bedrníkolistá a galská. Pouze v Podyjí se vyskytuje endemický jeřáb muk hardeggský.
V celém území se výrazně projevuje tzv. údolní fenomén, v jehož důsledku pronikají západním směrem do údolí teplomilné živočišné a rostlinné druhy z jihovýchodní teplé panonské oblasti. Naproti tomu ze západu migrují údolím druhy podhorské, s kterými se pak můžeme setkat na chladnějších a stinných severních svazích údolí.
Počet zvláště chráněných druhů rostlin je 77. K nejzajímavějším patří např.: kýchavice černá, měsíčnice vytrvalá, brambořík nachový, divizna nádherná, koniklec velkokvětý, kosatec dvoubarvý, volovec vrbolistý, 18 druhů orchidejí a mnoho dalších.
Unikátní plochy vřesovišť a stepních lad v jihovýchodní části parku vznikly ve středověku vykácením původních doubrav a následnou pastvou dobytka. Vřesoviště jsou významná zejména výskytem vzácných teplomilných druhů rostlin a hmyzu. Na území národního parku bylo zatím zjištěno 65 druhů savců, (např. vydra říční, netopýr Brandtův, hraboš mokřadní, bělozubka bělobřichá) a 152 druhů ptáků, z nichž asi 2/3 zde hnízdí (např. čáp černý, dudek chocholatý, včelojed obecný, výr velký, ledňáček říční). Ze 7 druhů plazů si největší pozornosti zaslouží užovka stromová a ještěrka zelená. Z obojživelníků patří k nejnápadnějším mlok skvrnitý, čolek velký a několik druhů žab. Ryby zastupuje především pstruh obecný, lipan podhorní, siven americký. V řece přežívá několik druhů ryb parmového pásma, které zde přirozeně žily před vystavěním Vranovské přehrady - ostroretka stěhovavá či parma obecná.
V parku je neuvěřitelně bohatě zastoupen hmyz. Z výčtu chráněných druhů jsou to například kudlanka nábožná, ploskoroh pestrý a pakudlanka jižní. Motýli jsou zastoupeni 12-ti zvláště chráněnými druhy (pestroklřídlec podražcový, otakárek ovocný a fenyklový, jasoň dymnivkový). Rovněž brouci jsou reprezentováni zajímavými druhy, např. nosorožík kapucínek, roháč obecný, tesařík obrovský atd.